产品介绍：
细胞中存在大量蛋白与 RNA 的复合物，它们的相互作用发挥重要的生物学 功能。 Dowobio™ RNA IP Kit 提供 Protein A/G 磁珠，可稳定结合目标抗体；通过与 细胞裂解产物孵育可高效富集目的蛋白及其复合物中的 RNA；通过 RNA 纯化可用于后续研究，如 qRT-PCR 、 RNA-sequencing 等。
保存说明：
Dowobio™ RNA IP (RIP) Kit, Part I，4℃储存（勿冷冻）
RNA IP (RIP) Kit, Part II，-20℃储存。
操作说明：
描 述： Dowobio™ RNA IP (RIP) Kit, 包含 Protein A/G Magnetic Beads, Dowobio™ RNA IP Lysis Buffer, RNA IP Buffer, RNase Inhibitor, 0.1 M DTT, 0.5 M EDTA, DNase I, Proteinase K, 10% SDS, Solution I, Solution II, Solution III, Nuclease -Free Water。
操作步骤：
细胞裂解及注意事项
1. 用标准的 RNA IP 裂解 buffer ( Dowobio™ RNA IP Lysis Buffer)并加入蛋白酶抑制剂处理细胞。
2. 至少需要 1 × 107 个细胞用于 RNA IP 实验。如被检测的 RNA 含量较低则需要更多的细胞。
3. 确保样品是新鲜的且无细菌等污染。
4. 制备好的样品(RNA IP Lysates)置于 -80℃保存。
免疫复合物制备
1. 用 Dowobio™ RNA IP Kit 提供的试剂按照下表配制 RNA IP Mix：
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试剂名称
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体积 (μL)
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终浓度
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RNA IP Buffer
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300
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-
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0.1 M DTT
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10
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1 μM
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RNase Inhibitor
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10
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400 U
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0.5 M EDTA
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30
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15 μM
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RNA IP Lysates
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500 μg
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-
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Antibody (Test or IgG)
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5 μg
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-
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用 RNA IP Buffer 补足至 1mL
2. 4℃旋转反应 2 小时或过夜。
RNA IP
1. 将 Protein A/G Magnetic Beads 充分混匀，吸取 50 μL 于新的无菌无酶离心管中。
2. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。
3. 将离心管从磁力架上取出，加入 100 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)，重悬磁珠。
4. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。
5. 重复步骤 2 和 3，2 次。
6. 将离心管从磁力架上取出， 加入 100 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)，重悬磁珠。
7. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。
8. 将离心管从磁力架上取出，加入 1 mL RNA IP Mix ，温和重悬磁珠。
9. 4℃旋转反应 2-4 小时。
10. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。
11. 将离心管从磁力架上取出， 加入 500 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)，温和混匀。
12. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。
13. 重复步骤 11 和 12，3 次。
14. 将离心管从磁力架上取出， 加入 500 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)，温和混匀。
15. 将离心管置于磁力架上， 收集磁珠，将上清液转移至新的无菌无酶离心管中，
用于后续分析。
16. 将离心管从磁力架上取出，加入 100 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)于磁珠离心管，再加入 5 μL DNase I (2 U/μL)，温和混匀。
17. 37℃旋转反应 10 分钟。
18. 加入 500 μL RNA IP Buffer，温和混匀。
19. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。
20. 将离心管从磁力架上取出，加入 500 μL RNA IP Buffer，温和混匀。
21. 用 Dowobio™ RNA IP Kit 提供的试剂按照下表配制 Proteinase Mix：
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试剂名称
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体积 (μL)
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终浓度
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RNA IP Buffer
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120
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-
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Proteinase K
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15
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150 μg
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10% SDS
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15
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-
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150 μL
22. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。
23. 将离心管从磁力架上取出，加入 150 μL Proteinase Mix，温和混匀。
24. 55℃旋转反应 20 分钟，或每 5 分钟温和重悬 1 次磁珠。
25. 将离心管置于磁力架上，收集上清液于新的无菌无酶水离心管，并加入 250μL RNA IP Buffer 至每管。
RNA Isolation
1. 加入 400 μL 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)至每管。
2. 涡旋 15 秒，室温 14,000 rmp 离心 10 分钟。
3. 取 350 μL 上清液至新的无菌无酶离心管，并加入 400 μL 氯仿。
4. 涡旋 15 秒，室温 14000 rmp 离心 10 分钟。
5. 取 300 μL 上清液至新的无菌无酶离心管。
6. 分别在每管中加入 50 μL Solution I，15 μL Solution II，2 μL Solution III，以及850 μL 预冷的无水乙醇。
7. 颠倒混匀，置于 -20℃或-80℃至少 1 小时或过夜，以沉淀 RNA。
8. 将离心管 14,000 rpm，4℃离心 30 分钟，弃掉上清液。
9. 加入 80%无水乙醇， 14,000 rpm，4℃离心 15 分钟， 弃掉上清液， 空气干燥。
10. 用 10 - 20 μL Nuclease -free water 溶解 RNA 沉淀， 置于冰上， 或 -80℃保存。
注意事项：
1. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
本产品在文章中的写法：
英文： Dowobio （Shanghai，China）
中文： 上海多沃生物科技有限公司 Dowobio，上海
